普瑞邦飼料中伏馬毒素HPLC檢測的解決方案

發(fā)布時間： 2019-03-29　　點擊次數(shù)： 1419次

伏馬毒素起因和特性

伏馬毒素主要是由串珠鐮刀菌菌f.moniliforme和f.proliferatum在一定溫度和濕度條件下繁殖所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。直到1988年，南非和美國的研究人員才從霉變的玉米中分離出伏馬毒素（fumonisins）b₁。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬菌素有FA₁、FA₂、FB₁、FB₂、FB₃、FB₄、FC₁、FC₂、FC₃、FC₄和FP₁共11種。糧食在加工、貯存、運輸過程中易受上述兩種真菌污染，特別是當溫度適宜時，更利于其生長繁殖，從而產(chǎn)生出一類結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的毒素，其中FB₁是其主要組分占60％以上，其毒性也大。因此，伏馬毒素可以通過糧食加工、飼料生產(chǎn)等過程對畜牧業(yè)乃至人類健康產(chǎn)生較嚴重的危害。

伏馬毒素純品為白色針狀結(jié)晶，為一類相關(guān)的極性、水溶性代謝產(chǎn)物，為多氫醇和丙三羧酸的雙酯化合物，對熱很穩(wěn)定，不易被蒸煮破壞，在多數(shù)糧食加工處理過程均比較穩(wěn)定。

食品污染狀況

FB₁對食品污染的情況在世界范圍內(nèi)普遍存在，主要污染玉米及玉米制品，其污染的飼料主要為以玉米為原料的飼料。FB₁為水溶性霉菌毒素，對熱穩(wěn)定，不易被蒸煮破壞，所以同AFT（黃曲霉毒素）一樣，控制農(nóng)作物在生長、收獲和儲存過程中的霉菌污染仍然是至關(guān)重要。

伏馬菌素對玉米的污染率和污染水平受國家和地區(qū)、玉米品種、季節(jié)的影響。1995年～1996年，Amra等對從埃及不同省份收集的120份樣品進行了檢測，結(jié)果顯示，冬季收集的白玉米和黃玉米FB1污染率均為高。伏馬菌素還可以污染其他糧食及其制品，且不同地區(qū)污染狀況也存在差異。

1996年我國對玉米、小麥等糧食作物中FB₁污染進行調(diào)查。發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)均有不同程度污染。我國食道癌高發(fā)區(qū)林縣的玉米伏馬菌素污染率為48%。因此，人們懷疑該地區(qū)食道癌高發(fā)與食用污染此毒素玉米相關(guān)。該毒素已被世界衛(wèi)生組織列為近年來首先進行研究的幾種霉菌毒素之一。

伏馬毒素的危害

1．馬大腦白質(zhì)軟化癥
　　這是一種馬的神經(jīng)失調(diào)疾病。根據(jù)1988年南非研究人員的試驗結(jié)果，每天以0.125mg／kg體重的水平給馬進行皮下注射，大約7天后馬開始發(fā)瘋、發(fā)狂，沖撞欄桿而死。解剖發(fā)現(xiàn)馬的大腦呈現(xiàn)白質(zhì)軟化癥狀。1989年，玉米中的伏馬毒素給美國有很多州的農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)造成了巨大的損失。
　　2．豬肺水腫
　　1992年和1994年美國和南非的科學家研究表明，每天伏馬毒素的攝取量在0.4mg／kg體重以上均可引發(fā)豬的肺水腫，還可造成豬生殖系統(tǒng)的紊亂，如早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎和發(fā)情周期異常等。這種病在美國及其他國家都有發(fā)現(xiàn)。
　　3．小鼠肝癌
　　1991年南非科研人員對小鼠進行了伏馬毒素的毒理試驗，試驗結(jié)果表明伏馬毒素引發(fā)肝癌。1998年又對大鼠進行了伏馬毒素毒理試驗，獲得相同的結(jié)果。
　　4．人類食道癌
　　早在1988年南非科學家就對食道癌發(fā)病率高和低的地區(qū)進行過調(diào)查，食道癌發(fā)病率與主食玉米受伏馬毒素污染呈正相關(guān)，進一步的動物試驗也得到了相同的結(jié)果。1994年中國學者和日本學者對食道癌高發(fā)區(qū)的河南省林縣進行了一次調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)主食玉米中伏馬毒素水平高達30~50mg／kg，發(fā)霉玉米中伏馬毒素高值達118.4mg／kg。目前伏馬毒素引發(fā)食道癌的機理還不清楚，需進一步確證和研究。

各國對伏馬毒素的*

2001年美國食品與藥物管理局(FDA)發(fā)布了供人類食用的玉米和玉米產(chǎn)品伏馬毒素高*指導性公告，規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素高*為2mg／kg；同時，FDA的畜牧醫(yī)學中心(CVM)也發(fā)布了動物飼料中伏馬毒素的高*指導性公告，規(guī)定其*范圍為1~50mg／kg。

　　表2 FDA對伏馬毒素在動物飼料中的推薦*（2000年6月）

玉米及其副產(chǎn)品用于下列動物飼料	推薦*（FB₁+FB₂+FB₃）,mg/kg
馬和兔	5ppm(不超過日食量的20%)*
豬和鯰魚	20ppm(不超過日食量的20%)*
產(chǎn)子的反芻動物、家禽、貂	30ppm(不超過日食量的20%)*
大于3月用于屠宰的反芻動物、用于制作裘皮的貂	60ppm(不超過日食量的20%)*
用于屠宰的家禽	100ppm(不超過日食量的20%)*
其他各種牲口和寵物	10ppm(不超過日食量的20%)*
*以干基作為計算基準

伏馬毒素的檢測

伏馬毒素的檢測先后使用過薄層色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、液相色譜法（HPLC）等，目前研究和應(yīng)用得多的是利用免疫親和柱凈化后的熒光儀檢測法和HPLC法。

普瑞邦伏馬毒素檢測方案介紹

（一） 免疫親和柱-液相色譜法：符合GBT 25228-2010 糧油檢驗玉米及其制品中伏馬毒素含量測定免疫親和柱凈化液相色譜法

Pribolab®（普瑞邦）應(yīng)用免疫親和柱凈化，利用液相色譜儀和熒光檢測器檢測可提供伏馬毒素測定的HPLC檢測方案，得出的結(jié)果準確可靠，檢出限好，是一種很好的檢測伏馬毒素的方法，僅供廣大用戶參考。

1. 設(shè)備和耗材配置　　

序號	品名	規(guī)格及參數(shù)	數(shù)量	用途
1	液相色譜儀		一臺	分析檢測
2	熒光檢測器		一臺	讀取熒光信號
3	Pribolab真菌毒素色譜柱	150/250mm 貨號：PRC-18	一支	配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測用
4	PriboFast®伏馬毒素免疫親和柱	3ml，25支/盒，貨號：IAC-050-3	若干	高特異性，純化樣本
5	高速均質(zhì)器	達到22000rpm 以上，貨號：EQ-WR-1L	一臺	耐腐蝕，高速，均質(zhì)
6	PriboFast®玻璃纖維濾紙	100P,110mm，1.5μm 貨號：GMF-110	一盒	霉菌毒素過濾
7	PriboFast®八位泵流操作架	貨號：EQ-PUMP-8	一臺	用于控制免疫親和柱過柱流速
8	伏馬毒素標準品	50µg/ml伏馬毒素B1, 50µg/ml伏馬毒素B2溶于乙腈/水（50/50）, 貨號：STD#2011	1ml	用于定量分析標準品的配制

2. 樣品前處理:普瑞邦為飼料提供不同的處理方案(詳細方案請聯(lián)系普瑞邦，普瑞邦開發(fā)了針對多種飼料基質(zhì)提供優(yōu)化的處理方案)

樣品處理：

花生，玉米，大米，小麥及其制品和飼料

----將50 g 研磨的樣品 + 5g鹽置于均質(zhì)杯中。

----加入100mL 甲醇：水（80：20）溶液。

----蓋上杯蓋，高速均質(zhì)5分鐘。

----4000r/min離心5min或用槽紋濾紙過濾；

----取10mL濾液并加入40mL PBS溶液將濾液稀釋，混勻。用玻璃微纖維濾紙過濾，取稀釋后液體待測；

----將上步稀釋液通過微纖維濾紙過濾，濾液收集于玻璃注射器筒中，量取10mL。

3. 免疫親和柱凈化:

操作程序：符合GB/T 25228-2010國標方法

----將免疫親和柱連接于泵流操作架的10mL注射器下。準確移取10mL樣品提取液注入注射器；

----富集:將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使提取液以約2-3mL/min(1滴/3秒)流速緩慢通過免疫親和柱，直至2-3mL空氣通過柱體；

----洗滌: 用10mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，再以10mL水淋洗柱子2次，棄去全部流出液，并使2-3mL空氣通過柱體；

----洗脫可采取以下方式之一進行: 優(yōu)選2

----洗脫1: 準確加入1.0mL色譜級甲醇洗脫,孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡),然后以流速為1-2mL/min過柱，收集全部洗脫液供檢測用。

----洗脫2: 為保證洗脫充分,建議以1.5mL色譜甲醇分兩步進行洗脫，流速為1-2mL/min(1滴/秒,重力即可) 。首先，加入0.5ml甲醇洗脫，重力過柱，當溶劑通過柱子后，等待30秒后再加入1ml甲醇進行洗脫，過柱前孵育30秒以上(孵育即甲醇在柱子中浸泡)。收集全部甲醇洗脫液供衍生化反應(yīng)用。

4. 衍生化反應(yīng)

分別取凈化后的樣本液和標準工作溶液各50ul，分別置于1ml的各個試管中，各加入50ul OPA衍生液，渦流混合器上混合30s，靜置3min后，立即取20ul衍生液進液相色譜儀分析。

5. 液相色譜分析

HPLC-色譜柱 ：C-18色譜柱   150 x 4.6 mm;
流動相 ：甲醇-0.1mol/L磷酸二氫鈉溶液 77:23
流速  ： 1 mL/min
柱溫  ：室溫
進樣體積： 20μL
熒光檢測器：λ-激發(fā)波長：335nm λ-發(fā)射波長：440 nm
HPLC配置：液相色譜儀帶有熒光檢測器

溫馨TIPS：

1. 谷物、飼料中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將谷物、飼料等貯存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。

2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員，必須注意防護，如穿戴隔離衣帽，在進行真菌分離培養(yǎng)工作時，應(yīng)戴口罩，并盡量防止孢子飛揚。

3. 操作臺面如有漏濺，應(yīng)立即用新配的5％次氯酸鈉消毒。以5％次氯酸鈉（NaOCl）處理時，黃曲霉毒素于數(shù)秒鐘內(nèi)即被破壞，故是常用的消毒劑。

4. 也有應(yīng)用生物學方法解毒的報道，生物學方法成本低，收效大，可能是一種有前途的除毒措施。

鑒于霉菌毒素對人體的危害，提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護自身安全哦！

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