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您的位置：網(wǎng)站首頁 > 技術(shù)文章 > 中藥材黃曲霉毒素檢測技術(shù)概述 一、 中藥材質(zhì)量安全現(xiàn)狀
中藥材是中醫(yī)防病治病的重要基礎(chǔ)。中藥材在田間生長、采收加工、儲藏運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)都會因污染霉菌而發(fā)生霉變。這些霉菌分泌的有毒代謝產(chǎn)物使中藥材發(fā)霉變質(zhì)，直接威脅到群眾的用藥安全。中藥中的霉菌毒素主要有AFT ，赭曲霉素，玉米赤霉烯酮，展青毒素，伏馬毒素等。中藥材的種類是影響真菌毒素污染的主要因素,易污染的中藥材,在不同的溫、濕度條件下均可產(chǎn)生真菌毒素。溫度和濕度條件也可以影響真菌毒素的增長,如：AFT 在不同的溫、濕度條件下均可以產(chǎn)生；赭曲霉毒素需要在濕度較高的條件下才能產(chǎn)生。
近年來,隨著中藥材在市場上的持續(xù)升溫,其安全性越來越引起人們的關(guān)注。真菌毒素殘留作為中藥材微量外源性有毒有害物質(zhì),一般不表現(xiàn)出急性毒性,但通常有較強的蓄積性,致癌、致畸、致突變作用明顯,嚴重影響中藥材的安全性。
二、 中藥材真菌毒素控制相關(guān)國家法規(guī)
近年來，各級食品藥品監(jiān)管部門不斷加大中藥監(jiān)管力度，努力保持中藥質(zhì)量總體穩(wěn)定。
國家食品藥品監(jiān)督管理局關(guān)于規(guī)范中藥生產(chǎn)經(jīng)營秩序嚴厲查處違法違規(guī)行為的通知（國食藥監(jiān)安[2012]187號文件）中，要求加強對AFT 、重金屬及有害元素、農(nóng)藥殘留量等安全性指標的檢測和控制，切實保證中藥材質(zhì)量和安全，另要求企業(yè)具備與生產(chǎn)品種相適應(yīng)的檢驗設(shè)備和能力，嚴把質(zhì)量檢驗關(guān)。
《國家藥品安全“十二五”規(guī)劃》，規(guī)劃中明確指出“開展藥品快速檢驗技術(shù)研究，搭建檢驗技術(shù)共享平臺”、“加快推進藥品快速檢驗技術(shù)在基層的應(yīng)用，配置快速檢驗設(shè)備”，“加強縣級機構(gòu)快速檢驗?zāi)芰ㄔO(shè)”的要求。
三、 中藥材真菌毒素檢測項目及*
國家食品藥品監(jiān)督管理局對柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎等14味藥材及其飲片品種項下增加“AFT ”檢查項目，限度為“AFT B1不得過5 μg/kg；AFT G2、AFT G1、AFT B2總量不得過10 μg/kg”。
2010 版《藥典》附錄IX V AFT 測定采用液相色譜法，另外增補藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學衍生法。
四、 中藥材AFT 檢測方案介紹
（一） 儀器分析法
特點
優(yōu)點 | 缺點 |
準確、靈敏、抗干擾性強，國家檢測部門的確證方法。 | 儀器成本高、對操作人員技術(shù)要求高、操作復雜、耗時較長。 |
免疫親和柱-液相色譜法：符合2010版《藥典》附錄IX V中AFT 測定液相色譜法，另外增補藥典描述該法檢測建立增加柱后光化學衍生法。
1. 設(shè)備和耗材配置
序號 | 品名 | 規(guī)格及參數(shù) | 數(shù)量 | 用途 |
1 | 液相色譜儀 |
| 一臺 | 分析檢測 |
2 | 熒光檢測器 |
| 一臺 | 讀取熒光信號 |
3 | Pribolab真菌毒素色譜柱 | 150/250mm 貨號：PRC-18 | 一支 | 配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測用 |
4 | PriboFast®AFT 總量免疫親和柱 | 3ml，25支/盒，快速過柱型， 貨號：IAC-011-3 | 若干 | 高特異性，純化樣本 |
5 | PriboFast®KRC光化學柱后衍生反應(yīng)裝置 | 貨號：EQ-KRC | 一臺 | 適用于AFT 檢測 |
6 | 高速均質(zhì)器 | 達到22000rpm 以上，貨號：EQ-WR-1L | 一臺 | 耐腐蝕，高速，均質(zhì) |
7 | PriboFast®玻璃纖維濾紙 | 100P,110mm，1.5μm 貨號：GMF-110 | 一盒 | 霉菌毒素過濾 |
8 | PriboFast®八位泵流操作架 | 貨號：EQ-PUMP-8 | 一臺 | 用于控制免疫親和柱過柱流速 |
9 | AFT 混標 | 2µg/mlAFT B1, G1;0.5µg/mlAFT B2;G2 (4/1/4/1)溶于乙腈, 貨號：STD#1081 | 1ml | 用于定量分析標準品的配制 |
2. 樣品前處理:普瑞邦為中藥材提供不同的處理方案(詳細方案請聯(lián)系普瑞邦，普瑞邦開發(fā)了針對多種中藥材基質(zhì)提供優(yōu)化的處理方案)
3. 免疫親和柱凈化:
富集--洗滌--洗脫--收集全部洗脫液供化學衍生檢測用。
4. 化學衍生
為什么使用光化學衍生器？ 由于黃曲霉具有較強的紫外吸收和產(chǎn)生熒光的特性，因此可以進行HPLC-紫外或熒光檢測，但是同時AFT 中的B1、G1 由于其在含水的流動相中容易產(chǎn)生熒光淬滅，因此在很多的實驗中都會采用衍生法測定AFT 。衍生的方法也很多：有柱前的，柱后的，在線的，由于在線的柱后光化學衍生有明顯的優(yōu)勢，所以現(xiàn)在被增補為藥典的檢測方法，優(yōu)勢主要在于無需任何化學試劑、對人員無傷害；無需人員直接操作、避免誤差; 無需擔心衍生液腐蝕檢測器。
5. 液相色譜分析
|
PriboFast KRC光化學衍生器 波長：254 nm 柱 溫 ： 35 °C HPLC配置；液相色譜儀帶有熒光檢測器；AFT 色譜柱 C18 150 x 4.6 mm |
（二）酶聯(lián)免疫法
特點
優(yōu)點 | 缺點 |
靈敏度高、耗時較短、樣本處理比較簡單、對技術(shù)人員要求不高、檢測成本低、可同時檢測大批量樣本。適用于大量樣本快速定量篩查。 | 可能存在一定假陽性率（交叉反應(yīng)率）。 |
Pribolab(普瑞邦)推出的PriboFastRAFT 總量試劑盒具有較高的靈敏度和準確度，適用于大量樣本的定量分析。
1. 方法原理
采用直接競爭酶聯(lián)免疫法，在微孔板上預(yù)包被AFT 抗原，加入樣本（或AFT 標準品溶液）及辣根過氧化物酶標記的AFT 特異抗體。樣本或標準品溶液中的抗原與預(yù)包被在板孔上的抗原競爭結(jié)合酶標抗體。未結(jié)合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣品吸光值與其所含AFT 總量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣品中AFT 總量的含量。
2. 設(shè)備和試劑配置：
序號 | 品名 | 規(guī)格及參數(shù) | 數(shù)量 | 用途 |
1 | PriboFastRAFT 總量試劑盒 | 96T，靈敏度：0.1ppb 貨號：EKT-011 | 一盒 | 定量分析檢測 |
2 | PriboSpin離心小柱 | 25T | 一盒 | 凈化樣本 |
3 | 酶標儀（酶聯(lián)免疫檢測儀） | 濾光片：450nm | 一臺 | 配套各類色譜儀，霉菌毒素檢測用 |
3. 樣本前處理：中藥材：粉碎、提取、離心，取上清液加入PriboSpin離心小柱進行凈化。
為什么要用PriboSpin離心小柱？中藥材的基質(zhì)復雜，提取時樣本液顏色較深，而且不容易去除。有機試劑提取凈化方法繁瑣，試劑揮發(fā)對環(huán)境及人體造成危害，且凈化效果不穩(wěn)定。用PriboSpin離心小柱，則只需提取液離心過柱，即可去除提取液中的雜質(zhì)，方便快捷，凈化效果好，且回收率可以達到85%以上。
4. 檢測步驟
4.1 免疫反應(yīng)30min；洗板5次；顯色反應(yīng)30min；終止反應(yīng)，酶標儀讀OD值。
5. 分析結(jié)果的表述
用酶標儀判讀結(jié)果。
（三）免疫金標快速檢測法
特點
優(yōu)點 | 缺點 |
操作簡單、費用低廉、耗時短、檢測快速。適用于樣本快速定性初步篩查 | 存在一定假陽性、數(shù)據(jù)不方便保存及分析。 |
Pribolab(普瑞邦)推出的PriboStripTMAFT 總量免疫金標快速檢測條特異性好，適用于檢測樣本量大；短時間出具檢測結(jié)果并控制經(jīng)費的情況，可以快速定性，初篩。
1. 方法原理
AFT 總量快速檢測條應(yīng)用了競爭抑制免疫層析的原理，樣本中的AFT 總量在酶標孔中與膠體金標記的特異性抗AFT 單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測線上AF－BSA偶聯(lián)物的結(jié)合。如果樣本中AFT 總含量大于0.5 ug/L，檢測線不顯顏色，結(jié)果為陽性；反之，檢測線顯紅色，結(jié)果為陰性。
2. 設(shè)備和試劑配置
序號 | 品名 | 規(guī)格及參數(shù) | 數(shù)量 | 用途 |
1 | PriboStripTMAFT 總量免疫金標快速檢測條 | 25T 檢測限：10ppb 貨號：PR-011 | 一盒 | 定性分析檢測 |
3. 分析步驟：中藥材粉碎溶解后取上清液檢測。吸取樣品滴加到加樣孔中，8-15分鐘讀取結(jié)果。在C線顯色的情況下：T 線顯色比C線深或一樣深是陰性。T 線顯色比C線淺，或無顯色是陽性結(jié)果。
五、 溫馨TIPS：
1. 中藥中真菌生長繁殖的有利條件主要是適宜的溫度與水分。如能將中藥貯存于10℃以下，水分保持在10％以下，就能有效地防霉。
2. 從事真菌毒素科研及檢測的人員，必須注意防護，如穿戴隔離衣帽，在進行真菌分離培養(yǎng)工作時，應(yīng)戴口罩，并盡量防止孢子飛揚。
3. 操作臺面如有漏濺，應(yīng)立即用新配的5％次氯酸鈉消毒。以5％次氯酸鈉（NaOCl）處理時，AFT 于數(shù)秒鐘內(nèi)即被破壞，故是常用的消毒劑。
4. 也有應(yīng)用生物學方法解毒的報道，生物學方法成本低，收效大，可能是一種有前途的除毒措施。
鑒于霉菌毒素對人體的危害，提醒各位奮斗在抗毒一線的老師們一定要注意保護自身安全哦！
關(guān)于Pribolab®（普瑞邦）
Pribolab®（普瑞邦）是面向提供霉菌毒素檢測解決方案的主要服務(wù)商之一，憑借強大的研發(fā)團隊和專業(yè)的霉菌毒素檢測技術(shù)的研究，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品加工與糧食、飼料工業(yè)等行業(yè)提供專業(yè)的霉菌毒素檢測技術(shù)與產(chǎn)品服務(wù)，同時為社會提供食品、飼料及飲料等的霉菌毒素、食品成分等檢測分析。
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